Щоб вибрати компетентні клітини для своїх експериментів, важливо переконайтеся, що ваш вибір відповідає вашим дослідницьким цілям. Ваше дослідження може включати різні конструкції ДНК, включаючи метильовану ДНК, великі плазміди, фагеміди, нестабільні конструкції з повторюваними послідовностями, бібліотеки ДНК та вектори експресії.
Компетентна клітина – це та, яка має здатність поглинати чужорідну ДНК. Фактори, що впливають на компетентність, включають: тип бактерій, наявність двовалентних катіонів, стан бактеріальних клітин і температура інкубації.
Вибір між двома методами визначається кількома факторами. До них відносяться ефективність трансформації, що відповідає плану експерименту, розмір і кількість ДНК, що підлягає трансформації, і наявне обладнання. У таблиці 1 наведено особливості хімічного перетворення та електропорації [1,2].
Які компетентні клітини слід використовувати для клонування та субклонування? Для клонування та субклонування вибирайте компетентні клітини з надвисокою ефективністю трансформації, наприклад GoldBio GB5-alpha™ (електрокомпетентні клітини або хімічно компетентні клітини) або GB10B™ alpha (електрокомпетентні клітини або хімічно компетентні клітини).
Компетентні клітинні протоколи
- охолодження клітин у присутності фосфату кальцію (№ за каталогом CAPHOS), щоб зробити їх проникними.
- інкубація з ДНК.
- обробка тепловим шоком при 42 °C протягом 60-120 секунд, що змушує ДНК проникати в клітини.
Однак більшість традиційних методів підготовки хімічно компетентних клітин складаються з наступних етапів.
- Крок 1: Інокуляція та вирощування клітин (3-4 години) …
- Крок 2: Охолодження клітин на льоду (10-15 хвилин)…
- Крок 3: Центрифугування та ресуспендування клітин (30 хвилин)